Gewilde Poste

Editor'S Choice - 2019

PCR (polimerase kettingreaksie)

Nie so lank gelede is 'n betroubare, hoogs sensitiewe en vinnige metode vir die diagnose van verskeie aansteeklike siektes ontwikkel nie. Hierdie metode staan ​​bekend as "PCR analise". Wat is dit, wat is die kern daarvan, watter mikroörganismes kan dit openbaar en hoe om dit reg te kry, sal ons in ons artikel vertel.

Discovery geskiedenis

Die Amerikaanse wetenskaplike Carey Mullis het in 1983 'n metode van polimerase kettingreaksie (PCR) uitgevind. Die metode van diagnose deur Cetus Corporation, waarin sy skepper gewerk het, is oorspronklik gepatenteer. Maar in 1992 is alle regte en patente aan Hoffman-La Roche verkoop. Daarna het dit geblyk dat parallelle soortgelyke studies uitgevoer is en deur ander Amerikaanse bioloë aangeteken is, soos Alice Chan, David Edgar en John Trell. In 1980 het Sowjet-wetenskaplikes A. Slyusarenko, A. Kaledin en S. Gorodetsky ook hierdie probleem hanteer. Daarom was dit nie moontlik om die alleenregtehouer te bepaal nie. Baie vooraanstaande biochemici het 'n besliste bydrae gelewer tot die ontwikkeling van die PCR-metodologie en het hul innovasies gepatenteer. Op die oomblik word PCR-analise oral in spesiale toegeruste laboratoriums uitgevoer.

Waarom het PCR diagnostiek sulke waarde?


Een van die belangrike voordele van die PCR-metode is hoë sensitiwiteit - van 95 tot 100%. Hierdie voordele moet egter gebaseer word op die onontbeerlike nakoming van die volgende voorwaardes:

  1. korrekte versameling, vervoer van biologiese materiaal,
  2. beskikbaarheid van steriele, besteebare instrumente, spesiale laboratoriums en opgeleide personeel,
  3. streng nakoming van metodes en steriliteit tydens die analise
Sensitiwiteit is verskillend vir verskillende waarneembare mikrobes. Byvoorbeeld, die sensitiwiteit van die PCR-metode vir die opsporing van hepatitis C-virus is 97-98%, en die sensitiwiteit vir die opsporing van ureaplasma is 99-100%.

Die moontlikhede wat inherent is aan PCR analise, stel ons in staat om onoortreflike analitiese spesifisiteit te bereik. Dit beteken die identifikasie van die mikro-organismes waarna u gesoek het, en nie soortgelyk of nou verwant nie.
Die diagnostiese sensitiwiteit en spesifisiteit van die PCR-metode is dikwels beter as dié van die kultuurmetode, die "goue standaard" genoem vir die opsporing van aansteeklike siektes. Gegewe die lengte van die kweek van die kultuur (van enkele dae tot 'n paar weke), word die voordeel van die PCR-metode voor die hand liggend.

PCR in die diagnose van infeksies
Die voordele van die PCR-metode (sensitiwiteit en spesifisiteit) bepaal 'n wye reeks toepassings in moderne medisyne.
Die belangrikste toepassings van PCR diagnostiek:

  1. diagnose van akute en chroniese aansteeklike siektes van verskillende lokalisering
  2. monitering van die effektiwiteit van die terapie
  3. spesifikasie van die tipe patogeen
PCR word gebruik in verloskunde, ginekologie, neonatologie, pediatrie, urologie, venereologie, nefrologie, kliniek van aansteeklike siektes, oftalmologie, neurologie, fisiopulmonologie, ens.

Die gebruik van PCR diagnostiek word uitgevoer in samewerking met ander navorsingsmetodes (ELISA, PIF, REEF, ens.). Hul kombinasie en opportuniteit word bepaal deur die behandelende dokter.

Aansteeklike patogene aangetref deur PCR

virusse:

  1. retrovirusse MIV-1 en MIV-2
  2. herpetiform virusse
  3. herpes simplex virus tipe 1 en 2
  4. cytomegalovirus
  5. Epstein-Barr virus
  6. varicella - zoster virus
  7. herpes menslike virusse 6 en 7
  8. hepatitis C, B en A
  9. menslike papillomavirus
  10. rubella virus
  11. adenovirussen
  12. rhinoviruses
  13. Parvovirus
  14. pikornovirusy

bakterieë:
  1. mikobakterieë
  2. chlamydia
  3. mycoplasma
  4. salmonella
  5. Legionella
  6. clostridia
  7. bleek treponema
  8. verskeie patogene tipes E. coli
  9. Vibrio cholerae
  10. rickettsias
  11. Staphylococcus aureus
  12. bakteriese veroorsakende middel van meningitis
  13. Helicobacter pylori
  14. ureaplasma
  15. veroorsakende middel van gonorree
  16. difteri stok
  17. hemofiele bacillus

Hierdie lys bevat die mees algemene aansteeklike middels wat deur PCR bespeur word. Trouens, hierdie lys is baie wyer, voortdurend opgedateer, aangesien nuwe "sade" gesintetiseer word. Daar moet ook kennis geneem word dat die lys van geïdentifiseerde patogene bepaal word deur die teenwoordigheid van "primers" vir identifikasie in die arsenaal van elke spesifieke laboratorium.

Wat is die kern van polimerase kettingreaksie?

PCR navorsing is 'n prestasie en 'n groot prestasie van molekulêre biologie. Dit is 'n metode wat deur die opsporing van mikrosites van DNA of RNA van vreemde genetiese materiaal (genoom) in staat is om individuele eienskappe inherent aan slegs een soort mikro-organismes te herken, sonder om dit met enige ander te verwar. Hoe werk die PCR-metode en hoe kan dit die prentjie van die gedrag van 'n besmettelike sel in 'n lewende organisme herstel?

PCR proses

Dus is 'n nukleïensuurfragment gevind, maar dit is alleen en nie genoeg om die reaksie uit te voer nie, daarom word dit gekodeer (kopiëring). Vir die verdere proses is egter 'n groot aantal sulke mikroplotte benodig, wat sy voortplanting kan verseker deur nuwe DNA-segmente wat identies is aan die gevind fragment (replikasie), te voltooi. Reproduksie is 'n natuurlike en inherente kenmerk van 'n nukleïensuur wat herhaal sal word polimerase ensiem selfs buite 'n lewende organisme (in 'n proefbuis met 'n monster), wat baie klone vorm, dit sal dit gaan kettingreaksie. Alle nuwe en nuwe fragmente sal gekloon word, maar slegs diegene waarin die navorser belangstel. Dis hoekom so Dit is belangrik om 'n "suiwer" analise te neem, sonder enige onsuiwerhede, en die toets baie noukeurig uit te voer.

Gegewe die vermoë van die polimerase kettingreaksie wat gelys is, kan mens raai waarom dit so maklik uraplasma onderskei van mycoplasma, of elk van hulle uit chlamydia.

Dus, selfs al is daar nie 'n deel van sy DNA in die miljoene selle van die menslike liggaam nie, maar slegs 'n deel van sy DNA, dan sal PCR, indien niks dit verhoed, waarskynlik die taak hanteer en die teenwoordigheid van die "vreemdeling" met 'n positiewe uitslag rapporteer. Dit is die kern van PCR en sy grootste voordeel.

Sterkte en swakpunte

Die laboratorium wat PCR diagnostiek uitvoer, het die hoogste vereistes ten opsigte van toerusting, toetsstelsels en kwalifikasies van mediese personeel. Dit is 'n hoë-tegnologie laboratorium met 'n arsenaal van hoogs sensitiewe en hoogs spesifieke reagense, so dit het geen spesifieke nadele. Is dit wat 'n positiewe uitslag gee in die afwesigheid van kliniese manifestasies, en plaas die kliniek dus voor die dilemma: moet ek begin met behandeling of nie?

Die dokter, wat die pasiënt waarneem, begin om die betroubaarheid van die toetsuitslae te betwyfel, aangesien hy geen tekens van die siekte sien nie. Maar nog steeds Gegewe die hoë sensitiwiteit van die PCR-stelsel, moet onthou word dat dit die patogeen, selfs in die prekliniese stadium, opspoor, en 'n positiewe uitslag in hierdie geval is meer voordeel as 'n nadeel. Op grond hiervan moet die behandelende geneesheer besluit oor die toepaslikheid van terapie, met inagneming van ander voor- en nadele.

Die voordele van diagnostiek met behulp van polimerase kettingreaksie is voor die hand liggend:

  • Hoë spesifisiteit100% bereik as gevolg van die teenwoordigheid in die monster van nukleïensure wat inherent is aan 'n bepaalde organisme, maar uitheemse vir die mens,
  • Hoë prestasieomdat PCR is 'n hoë-tegnologie outomatiese tegniek wat bied die vermoë om te toets op die dag van die neem van die materiaal en ontslae te raak van die pasiënt van onnodige steurnisse,
  • PCR, wat op een monster werk, kan verskeie studies uitvoer en oorontdek verskeie patogene, as sy so 'n taak sal wees. Byvoorbeeld, by die diagnose van chlamydiale infeksie, waar PCR een van die belangrikste metodes is, saam met chlamydia, is dit moontlik om die neisseria (gonokokkus), die veroorsakende middel van gonorree, op te spoor. Daarbenewens word die betroubaarheid van die resultate nie negatief beïnvloed nie,
  • PCR toets joutoon gevaarlike mikroörganismes in die inkubasieperiodewanneer hulle nie tyd gehad het om aansienlike skade aan die liggaam te veroorsaak nie, is die vroeë diagnose waarsku oor die naderende ontwikkeling van die patologiese proses, wat dit moontlik maak om daarvoor voor te berei en dit ten volle gewapen te maak.

Daarbenewens, om misverstande te vermy, wat soms tydens diagnose voorkom, beskerm PCR hom deur die feit dat sy resultate (foto, rekenaar) vasgestel kan word vir die doel om dit vir kundige doeleindes te gebruik, indien nodig.

'N Negatiewe reaksie word as normaal beskou in PCR-antwoorde., wat die afwesigheid van fragmente van vreemde nukleïensure aandui, sal 'n positiewe reaksie die teenwoordigheid van infeksie in die liggaam aandui. Digitale waardes dui op die toestand van die virus en die konsentrasie daarvan tydens die toetsing. 'N Volledige dekodering van die analise word egter uitgevoer deur 'n dokter wat 'n spesiale studie oor die onderwerp van PCR ondergaan het. Om die uitslae op u eie te probeer interpreteer, maak nie sin nie, aangesien dit moontlik is om verkeerd te verstaan ​​en vooraf te bekommer.

Wat vrees die PCR, wat kan dit doen en hoe om dit voor te berei?

Soos in enige ander studies, Soms toetsresultate blyk vals positief of vals negatief te weeswaar PCR geen uitsondering is nie. Dit kan in die volgende gevalle gebeur:

  1. Oortredings van die proses in een stadium van die reaksie,
  2. Nie-nakoming van die reëls vir die insameling van materiaal, die berging of vervoer daarvan,
  3. Die teenwoordigheid van onsuiwerhede in die materiaal.

Dit dui daarop dat die PCR diagnose van infeksies versigtig, versigtig en versigtig benader moet word, anders kan die monsters van die materiaal hul strukturele struktuur verander of selfs ineenstort.

Stadiums van PCR diagnostiek. Valse resultate kan op enige stadium van die studie onreëlmatighede veroorsaak.

PCR diagnose van infeksies behoort tot die kategorie van "goudstandaarde" onder ander laboratoriummetodes, sodat dit gebruik kan word om patogene van baie siektes te soek wat by die eerste oogopslag niks gemeen het met mekaar nie:

  • Tuberkulose van verskillende lokalisering, longontsteking (insluitend atipies, veroorsaak deur chlamydia),
  • Kinderinfeksies (masels rubella, parotitis, masels),
  • witseerkeel,
  • salmonellose,
  • Zoönotiese aansteeklike siekte - listeriose (die siekte word gekenmerk deur 'n verskeidenheid simptome met skade aan die limfknope, sentrale senuweestelsel, interne organe),
  • Siektes wat veroorsaak word deur die penetrasie van die Epstein-Barr-virus (aansteeklike mononukleose, ens.),
  • Kankerpatologie veroorsaak deur HPV infeksie (HPV en sy tipes),
  • Borreliose (Lyme-siekte, bosluisgebonde enkefalitis),
  • Helicobacter pylori infeksie, wat veroorsaak word deur die menslike Helicobacter pylori mikrobe wat in die menslike maag leef. Dit is bewys dat Helicobacter kanker van die maag of duodenum veroorsaak 12,
  • Kandidiasis en feitlik alle SOS'e.

PCR diagnose van seksueel oordraagbare infeksies is van besondere belang, aangesien die siektes wat so veroorsaak word, dikwels sonder enige kliniese manifestasies aanhou, maar dan word hulle meer aktief tydens swangerskap en sodoende die gesondheid en selfs die lewe van die kind bedreig. TORCH infeksies tree ook op soortgelyke wyse op. Sommige van hulle ("steek") is gelyktydig van toepassing op STI's, daarom vereis laasgenoemde meer nadere oorweging. Die leser sal in staat wees om kennis te maak met die gewildste tegnieke in die volgende artikels.

Hoe om behoorlik voor te berei om 'n betroubare resultaat te kry?

Onmiddellik let ons daarop dat die voorbereiding vir PCR redelik eenvoudig is, wat geen spesiale inspanning van die pasiënt vereis nie. Jy hoef net drie eenvoudige take te voltooi:

  1. Moet nie seksuele omgang 24 uur voor die toets hê nie,
  2. Vir die insameling en analise van bloed uit 'n aar moet jy op 'n leë maag kom, want dit is ook onmoontlik om te drink,
  3. Oorhandig urine moet nag (in die oggend - in 'n steriele kruik, die dag voor die apteek aangekoop).

PCR kan in enige biologiese omgewing werk

Die PCR-metode is nie "bloeddorstig" nie, daarom aanvaar dit enige biologiese medium wat die vermeende aansteeklike middel bevat. Die keuse - wat jy vir navorsing moet neem, bly vir die dokter.

Dus, in die soeke na 'n patogeen, benewens 'n bloedtoets (hoewel dit ook pas en in die meeste gevalle parallel met 'n ander materiaal geneem word), kan jy:

  • Smeer (urogenitale kanaalafvoer),
  • Skraap slymvliese van die mond, konjunktiva, nasofarinks, genitale kanaal (vroue neem van die serviks en vagina, mans - uit die uretra),
  • speeksel,
  • semen,
  • Prostaat sap,
  • Placental weefsels en vrugwater (amniotiese vloeistof),
  • Urine sediment (na sentrifugering), byvoorbeeld, om sekere STI's en Mycobacterium tuberculosis op te spoor,
  • Sputum en pleurale vloeistof vir dieselfde doel
  • uitskeidings,
  • Serebrospinale vloeistof in gevalle van vermoedelik aansteeklike letsels van die sentrale senuweestelsel,
  • Biopsie materiaal (biopsie), geneem uit die lewer, duodenum, maag, ens.

Ek wil hierbo byvoeg dat die materiaal vir toetsing in alle gevalle, selfs in skrape en uitskeidings, voldoende sal wees, aangesien toetsing van die PCR-metode nie groot volumes benodig nie, is daar genoeg analise en 'n paar mikroliter, wat gewoonlik in 'n mikrobuis van Eppendorf-tipe gebruik word en na studie.

MIV en polimerase kettingreaksie

Gewoonlik word die diagnose van MIV-infeksie herhaaldelik herhaal wanneer 'n anonieme opname oorgedra word in die geval van positiewe resultate van immunoblotting. As die diagnose bevestig word, word die pasiënt addisionele studies voorgeskryf:

  1. Gebruik immunologiese reaksies om die absolute waardes van die aantal limfosiete CD te bepaal4 (immunokompetente selle - T-helpers of helpers), wat die infeksie in die eerste plek voorkom, waarna hulle hul basiese eienskappe verloor en nie kan onderskei tussen "hulle" en iemand anders nie. " RNA van die virus wat in die bloedplasma sirkuleer, word as die normale selle van die liggaam geneem en reageer nie daarop nie,
  2. Deteksie van virus-RNA deur PCR en berekening van die konsentrasie van virusdeeltjies om die stadium, die erns van die patologiese proses en die voorspelling op grond van hierdie data te bepaal. Natuurlik bestaan ​​die woord "norm" in hierdie opsig nie, aangesien die reaksie altyd positief is en die numeriese waardes ontsyfer is binne die bevoegdheid van die dokter.

PCR en hepatitis

Hepatitis C patogene kan deur PCR opgespoor word, meestal word die toets gebruik om C hepatitis te diagnoseer, wat swak opgespoor word deur ander metodes.

Hepatitis C-virus (RNA-bevattende) in sy gedrag in die menslike liggaam lyk soos MIV. In die genoom van lewerselle (hepatosiete) wyk hy daar en wag vir sy uur, wat na 2 jaar, ten minste 20 jaar kan kom, sodat die dokters hom 'n sagte moordenaar genoem het. Hepatitis C lei tot die vorming van 'n kwaadaardige proses in die hepatiese parenchiem, wat hom in die latere stadiums manifesteer. Die immuunstelsel merk nie al hierdie gebeure op nie, en neem die virus vir 'n hepatosiet. True, teenliggaampies vir die virus in sommige hoeveelhede word geproduseer, maar hulle bied nie 'n ordentlike immuunrespons nie. Vir die diagnose van ELISA vir hepatitis C is dit nie baie insiggewend nie, want dit dui daarop dat die virus spore verlaat het, en of hy self weg is, onbekend is. In HCV gevalle van selfheling is bekend, terwyl teenliggaampies teen die virus bly en voortgaan om te sirkuleer vir die lewe (immunologiese geheue). PCR aansienlik voor die vorming van teenliggaampies en kan na 1 tot 5 weke 'n virale deeltjie opspoor, terwyl teenliggaampies tussen 2 maande en ses maande kan voorkom.

PCR diagnose in die geval van vermoede van 'n botsing van hepatitis C-virus in die menslike liggaam is die mees optimale navorsingsmetode, aangesien dit slegs die teenwoordigheid van 'n "sagte vyand" in die pasiënt se bloed- of lewerbiopsie kan herken.

Soms is daar egter gevalle waar AT positief is, en die gevolg van PCR is negatief. Dit gebeur soms met 'n baie lae hoeveelheid virus of wanneer dit in die lewer dormant is sonder om in die bloedstroom te gaan. Om die waarheid te vind, word die pasiënt heranaliseer, of selfs meer as een.

Menslike papillomavirus infeksie

HPV (menslike papillomavirus), as selfheling nie plaasvind nie, kan ook sonder om te manifesteer, lank in die liggaam van die gasheer bly staan, wat nie eens daarvan vermoed word nie, aangesien PCR nie gedoen is nie en die simptome afwesig was. Die teenwoordigheid van menslike papillomavirus-infeksie, alhoewel latent, is egter ver van onverskillig vir menslike gesondheid, waar sekere soorte virus kanker veroorsaak, veral gevaarlik is (tipe 16, 18).

Meer dikwels, die vroulike helfte van die bevolking ly aan HPV, aangesien die virus die vroulike genitale meer en veral die serviks liefhet, waar sommige tipes virusse bydra tot die ontwikkeling van dysplastiese prosesse, en dan servikale kanker, as jy nie dysplasie behandel nie en die virus gratis bevry. Так вот, полимеразная цепная реакция обнаружит вирусную ДНК, а затем укажет «плохой» или «хороший» (онкогенный или неонкогенный) тип поселился в организме женщины.

Другие ИППП и TORCH-инфекции

Очевидно, что полимеразная цепная реакция может найти любую чужеродную структуру, состоящую из нуклеиновых кислот, поэтому данный тест подходит для выявления всех ЗППП и TORCH-инфекций, тем не менее, он далеко не всегда используется. Зачем, скажем, проводить такие дорогие исследования для обнаружения трихомонады или гонококка, если есть более доступные и дешевые?

TORCH infeksies en SOI's is so verwant dat dit soms moeilik is om te bepaal aan watter groep 'n spesifieke patogeen toegewys moet word. Hulle is oor die algemeen moeilik om te verstaan, aangesien dit baie uiteenlopende groepe mikroörganismes is wat altyd seksueel oordraagbaar is of slegs onder sekere toestande (immunodefektuur) en mag slegs van belang wees tydens swangerskap weens die moontlike negatiewe impak op die kursus en op die fetus.

PCR - die belangrikste metode vir die opsporing van verborge infeksies

Die ontwikkeling van kliniese manifestasies is gebaseer op verskeie patogene, wat slegs deur PCR gevind kan word, wat die hooftaak is, soms saam met ELISA, en soms as die enigste bevestigende toets, veral as die simptome van die siekte afwesig is. So 'n moeilike situasie kan 'n polimikrobiese infeksie skep, wat bykomend tot openlike veroorsakende agente ook opportunistiese patogene insluit.

By mans wat aan inflammatoriese siektes van die geslagsfeer ly, word uretritis, chlamydia, ureaplasma en mycoplasma byvoorbeeld bespeur. Hierdie soort tipes is gevaarlik en die vroulike liggaam. Diegene wat chlamydia se perfidie ken en daardeur gekyk het, sal sekerlik onthou hoe moeilik dit is om dit te vind en te herken. Daarom is die analise wat deur PCR op chlamydia gemaak word, veral vertrou, omdat die parasiet wat in 'n sel van baie klein dimensies wegkruip, versigtig optree en altyd skaad stilletjies.

Ureaplasma word dikwels beskou as gepaard met mycoplasma. En dit is geen toeval nie. Hierdie spesies, soos chlamydia, is nie virusse of bakterieë nie, hulle leef in selle en behoort aan SOI's, hoewel hul teenwoordigheid in 'n gesonde organisme ook ver van ongewoon is. Om sodoende 'n gesonde draer van 'n siek persoon te onderskei, is spesiale metodes nodig waar PCR as die betroubaarste beskou word, aangesien ander studies weens die aard van die struktuur en gedrag van hierdie mikroörganismes ondoeltreffend is.

Wat die herpesvirus (tipe 1, 2) en sitomegalovirus betref, wat ook aan herpesvirusse (tipe 5) behoort, is die situasie hier ook dubbelsinnig. Infeksie van die wêreld se bevolking is 100% nader, so in hierdie geval is die identifikasie van die virus en die dosis baie belangrik. Dit speel veral 'n rol tydens swangerskap, want 'n volwassene wat wortel in sy liggaam gewortel het, veroorsaak dikwels geen probleme en gee geen tekens van die siekte nie.

Daarom moet 'n soortgelyke ondersoek deur 'n dokter voorgeskryf word, nie geïgnoreer word nie, want in sommige gevalle is die polimerase kettingreaksie 'n onontbeerlike en noodsaaklike metode van laboratoriumdiagnose wat nie net 'n vrou kan beskerm nie, maar ook 'n klein, ongebore persoon met ernstige komplikasies.

Ten slotte wil ek daarop let dat so 'n wonderlike metode, soos PCR, die mensdom vir meer as 30 jaar bedien. Terselfdertyd is die take van die toets nie beperk tot die soeke na patogene van aansteeklike siektes nie. Polimerase kettingreaksie, gebore op grond van molekulêre biologie, is onlosmaaklik verbind met genetika, dit suksesvol gebruik in forensiese sake vir persoonlike identifikasie, in forensiese medisyne vir die vestiging van vaderskap, in veeartsenykundige medisyne, indien die kliniek vir diere die geleentheid het om duur toerusting te bekom, sowel as in ander gebiede (industrie, landbou, ens.).

Die kern van die metode van PCR diagnostiek

PCR analise: wat is dit en hoe werk dit? Die essensie van die metode bestaan ​​daarin om 'n spesiale DNA-polimerase ensiem in vitro te gebruik om die volume van 'n sekere mikrobiese omgewing te verhoog. Om dit te doen, vermeerder die beskikbare DNA materiaal. Dus, in die teenwoordigheid van 'n patogene mikro-organisme in die monster, sal die hoeveelheid daarvan verhoog word as gevolg van biochemiese laboratorium manipulasies, en die bakterie sal nie moeilik wees om in 'n mikroskoop op te spoor nie.

Hoe is die navorsingsmateriaal?

Vir die vereiste ontleding:

  • DNA matriks
  • primers wat die punte van 'n stuk materiaal verbind
  • hittebestande DNA-polimerase ensiem,
  • chemikalieë wat ensieme behoorlik werk,
  • buffer oplossing wat nodig is om geskikte toestande te skep vir die groei en ontwikkeling van DNA-materiaal.

Om PCR uit te voer voer 25-30 herhalings uit, bestaande uit drie stadiums: denaturering, uitgloeiing en verlenging.

Vir die analise van polimezar kettingreaksie met behulp van 'n spesiale toestel - die versterker. Moderne toerusting stel u in staat om die nodige program van verwarmings- en verkoelingsbuise te installeer om foute tydens diagnose uit te skakel.

Waar is die diagnose toegepas?

Die polimezare kettingreaksie metode word in verskillende velde van medisyne gebruik:

  • kriminoloë gebruik dit om genetiese materiaal te identifiseer, soos hare, speeksel of bloed,
  • 'N PCR bloed toets help met genotipering, byvoorbeeld, 'n individuele geneties geïnkorporeerde reaksie op 'n spesifieke geneesmiddel op te spoor,
  • deur hierdie metode te gebruik, bepaal die bestaan ​​van verwantskap tussen mense
  • Die gewildste PCR-metode het in mediese diagnostiek geword vir die bepaling van verskeie aansteeklike siektes.

Watter infeksies onthul PCR?

So, medisyne het lank en suksesvol die analise van PCR gebruik. Wat dit is, het ons reeds geleer. En watter patogene kan daarmee opgespoor word? Die volgende aansteeklike siektes word deur PCR gediagnoseer:

  • Hepatitis A, B, C,
  • ureaplasmosis,
  • candidiasis,
  • chlamydia,
  • mycoplasmose,
  • bakteriële vaginosis,
  • aansteeklike mononukleose,
  • trigomoniase,
  • menslike papillomavirus infeksie
  • tuberkulose,
  • herpes infeksie van die 1ste en 2de tipes,
  • Helicobacter pylori infeksie,
  • cytomegalovirus,
  • witseerkeel,
  • salmonellose,
  • MIV-infeksie.

Ook, PCR metodes word gebruik in die diagnose van kanker.

Voordele van die metode

Diagnose van PCR het verskeie voordele:

  1. Hoë sensitiwiteit. Selfs met slegs 'n paar DNA molekules van 'n mikro-organisme bepaal PCR-analise die teenwoordigheid van infeksie. Dit sal die metode vir chroniese en latente siektes help. Dikwels word die mikro-organisme in sulke gevalle op ander maniere onkweek.
  2. Enige materiaal is geskik vir navorsing, byvoorbeeld speeksel, bloed, geslagsafskeidings, hare, epiteelselle. Die mees algemene is 'n bloedtoets en urogenitale smeer op PCR.

Aanbevelings vir voorbereiding vir analise

Ten einde die resultate betroubaar te wees wanneer 'n PCR-studie uitgevoer word, is dit nodig om die analise te slaag, na aanleiding van die aanbevelings oor voorlopige voorbereiding vir diagnose:

  1. Voor die aflewering van speeksel moet 4 uur voor die versameling van materiaal nie voedsel en medisyne eet nie. Spoel jou mond onmiddellik voorgekom met gekookte water.
  2. Bogenoemde reëls moet gevolg word wanneer 'n monster van die binnekant van die wang geneem word. Na die spoel word dit aanbeveel om 'n ligte massage van die vel uit te voer om die geheim van die klier uit te lig.
  3. Urine word gewoonlik by die huis ingesamel. Hiervoor moet jy 'n versigtige toilet van die geslagsorgane hou. In 'n steriele plastiekhouer moet 50-60 ml urine afgehaal word. Om die suiwerheid van die materiaal te verseker, word dit aanbeveel vir vroue om 'n tampon in die vagina te plaas en vir mans om die vel soveel as moontlik te laat vou. U kan nie die materiaal gedurende die menstruasieperiode slaag nie.
  4. Om sperms te skenk, moet jy 3 dae lank weerhou van omgang voordat jy die materiaal neem. Ook, dokters adviseer jou om nie na die sauna te gaan en 'n warm bad te drink nie, alkohol en pittige kosse te drink. 3 uur voor die analise moet jy weerhou van urinering.
  5. Vir die lewering van 'n urogenitale smeer, byvoorbeeld, indien PCR chlamydia ontleed word, word beide vroue en mans aanbeveel om seksuele rus vir 3 dae te hê. 2 weke voor die analise kan nie antibakteriese middels neem nie. Vir 'n week moet jy stop met die gebruik van intieme gels, salf, vaginale setpille, douching. 3 uur voor die toets moet jy weerhou van urinering. Tydens menstruasie word die materiaal nie versamel nie, slegs 3 dae na die beëindiging van bloedontlading, kan 'n urogenitale smeer geneem word.

PCR tydens swangerskap

Terwyl jy op 'n baba wag, is baie seksueel oordraagbare infeksies uiters gevaarlik vir die normale ontwikkeling van die fetus. SOS'e kan intraderiene groeivertraging, miskraam of voortydige geboorte veroorsaak, en aangebore misvormings van 'n kind. Daarom is dit uiters belangrik om tydens vroeë swangerskap 'n PCR-ondersoek te ondergaan. Om te slaag is die analise nodig vir registrasie - tot 12 weke.

Die materiaal word uit die servikale kanaal geneem deur 'n spesiale borsel te gebruik. Die prosedure is pynloos en maak nie 'n gevaar vir die baba nie. Gewoonlik tydens swangerskap word chlamydia deur die PCR-metode ontleed, asook deur ureaplasmose, mycoplasmose, sitomegalovirus, herpes, papillomavirus. So 'n komplekse opname genoem PCR-6.

PCR vir MIV-diagnose

As gevolg van die feit dat die polimerase kettingreaksie baie sensitief is vir veranderinge in die liggaam en die diagnosetoestande, kan baie faktore die resultaat beïnvloed. Daarom is die PCR-analise vir MIV-infeksie nie 'n betroubare metode nie, die doeltreffendheid daarvan is 96-98%. In die oorblywende 2-4% van die gevalle gee die toets vals positiewe resultate.

Maar in sommige situasies is dit onmoontlik om sonder PCR diagnose van MIV te doen. Gewoonlik word dit uitgevoer aan mense met 'n vals negatiewe uitslag van ELISA. Sulke aanwysers dui daarop dat 'n persoon nog nie teenliggaampies teen die virus ontwikkel het nie en dit is onmoontlik om dit sonder 'n veelvoudige toename in die getal te bepaal. Dit is wat bereik kan word deur 'n bloedtoets met behulp van die PCR-metode.

So 'n diagnose is ook nodig vir kinders van die eerste lewensjaar wat aan 'n MIV-positiewe moeder gebore is. Die metode is die enigste manier om die status van die kind betroubaar te bepaal.

PCR vir die diagnose van hepatitis

Die metode van polimerase kettingreaksie kan die DNA van hepatitis A, B, C virus lank voor die vorming van teenliggaampies teen infeksie of die aanvang van simptome van die siekte opspoor. Die PCR-analise vir hepatitis C is veral effektief, aangesien in 85% van die gevalle so 'n siekte asimptomaties is en na 'n chroniese stadium sonder tydige behandeling gaan.

Vroeë opsporing van die patogeen sal help om komplikasies en langtermynbehandeling te vermy.

Omvattende PCR-ondersoek

Omvattende PCR-analise: wat is dit? Dit is 'n polimerase kettingreaksie. Dit behels die identifikasie van verskeie tipes infeksies op dieselfde tyd: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, cytomegalovirus, ureaplasma urealytikum, herpes simplex van die 1ste en 2de tipes, gonorree, sifilis, papilomavirus, papilomavirus, papilomavitis, herpesitis van die 1e en 2e tipes, gonorree, pymplasma. Die prys van sodanige diagnose wissel van 2000 tot 3500 roebels. afhangende van die kliniek, gebruikte materiale en toerusting, sowel as die tipe analise: kwalitatief of kwantitatief. Wat nodig is in jou geval - die dokter sal besluit. In sommige gevalle is dit genoeg om net die teenwoordigheid van die patogeen te bepaal, byvoorbeeld in geval van MIV-infeksie, word 'n belangrike rol gespeel deur die kwantitatiewe titer. By die diagnose van al bogenoemde patogene word die opname "PCR-12-analise" genoem.

Ontcijfering van die resultate van die analise

Dekodering van PCR-analise is maklik. Daar is slegs 2 skale van die aanwyser - 'positiewe resultaat' en 'negatiewe resultaat'. Wanneer 'n patogeen opgespoor word, kan dokters met 99% sekerheid die teenwoordigheid van die siekte bevestig en voortgaan met die behandeling van die pasiënt. In die kwantitatiewe metode om die infeksie in die toepaslike kolom te bepaal, word 'n numeriese aanwyser van bespeurde bakterieë aangedui. Slegs 'n dokter kan die omvang van die siekte bepaal en die nodige behandeling voorskryf.

In sommige gevalle, byvoorbeeld, in die bepaling van MIV-infeksie deur PCR, met 'n negatiewe uitslag, is dit nodig om addisionele eksamens te doen om die verkryde aanwysers te bevestig.

Waar om die analise te neem?

Waar gaan die PCR-analise deur: in die openbare kliniek of in 'n privaat laboratorium? Ongelukkig is die toerusting en metodes in munisipale mediese instellings dikwels verouderd. Daarom is dit beter om private laboratoriums met moderne toerusting en hoogs gekwalifiseerde personeel te verkies. Daarbenewens sal jy in 'n privaat kliniek baie vinniger resultate kry.

In Moskou bied baie private laboratoriums PCR-analise aan vir verskeie infeksies. Byvoorbeeld, in sulke klinieke soos Vita, Komplekse Clinic, Happy Family, Uro-Pro, ontleed hulle PCR. Die prys van die opname is van 200 roebels. vir die bepaling van een patogeen.

Daar kan afgelei word dat die diagnose van aansteeklike siektes deur PCR in die meeste gevalle 'n vinnige en betroubare manier is om die patogeen in die liggaam op te spoor in die vroeë stadiums van infeksie. Maar in sommige gevalle is dit die moeite werd om ander diagnostiese metodes te kies. Slegs 'n spesialis kan die behoefte aan so 'n studie bepaal. Dekodering van PCR analise vereis ook 'n professionele benadering. Volg die aanbevelings van die dokter en neem nie hul eie toetse, wat nie nodig is nie.

Die voordele van PCR diagnose in moderne medisyne:

• Direkte opsporing van die teenwoordigheid van 'n patogeen (naamlik 'n spesifieke streek van die DNA of RNA van die patogeen) in die monster wat ondersoek word.
• Hoë spesifisiteit laat jou toe om 'n unieke DNA of RNA-streek te identifiseer wat kenmerkend is van 'n spesifieke patogeen, wat die moontlikheid van vals reaksies uitskakel.
• Die hoë sensitiwiteit van die PCR-metode maak dit moontlik om selfs enkele selle van patogene (virusse, bakterieë) op te spoor. Die sensitiwiteit van PCR-analise is 10-1000 selle in die monster wat ondersoek word (byvoorbeeld, die sensitiwiteit van immunologiese en mikroskopiese toetse is slegs 103-105 selle).
• Ontwikkeling van 'n universele PCR-metode vir die opsporing van verskeie patogene. Die voorwerp vir navorsing deur PCR is die genetiese materiaal (DNA, RNA) van die patogeen. Die tegniek kan verskeie patogene uit 'n enkele biologiese monster identifiseer.
• Snel genoeg om die uitslag van die analise te kry. Volle navorsing word uitgevoer in 4-4,5 uur, minder dikwels - 'n bietjie langer.
• Die moontlikheid om patogene op te spoor voor die aanvang van simptome (prekliniese diagnose) en na die laaste siekte (terugwerkende diagnose). 'N Voorbeeld van prekliniese diagnose sal tydens die inkubasieperiode ondersoek word (vanaf die oomblik van infeksie tot die pasiënt se klagtes ontstaan), asook latente infeksie (wanneer daar geen simptome is nie, maar slegs laboratoriumdata - byvoorbeeld PCR). Een van die belangrike punte van PCR diagnose is die PCR in argiefmateriaal of biologiese residue, wat belangrik is vir die identifikasie van 'n persoon of vaderskap.

Tans word PCR-diagnostiek beduidende ontwikkeling ondergaan. Die metode self word verbeter, nuwe tipes PCR verskyn keer op keer, nuwe toetsstelsels vir hierdie reaksie kom na die mediese mark. As gevolg hiervan word die koste van PCR-studies elke jaar meer toeganklik vir 'n wye verskeidenheid pasiënte.

Waarvoor is die PCR-metode gebaseer?

Die basis van die polimerase kettingreaksie is herhaalde verdubbeling (versterking) van 'n sekere gedeelte van DNA of RNA met behulp van ensieme in die laboratorium. Die resultaat is die hoeveelheid DNA of RNA wat voldoende is vir visuele analise. In die loop van die studie word slegs die area wat onder die gespesifiseerde toestande pas, gekopieer, en slegs in die omstandighede van die teenwoordigheid in die steekproef.

Byvoorbeeld, die materiaal vir die studie, wat die teenwoordigheid van DNA-fragmente of RNA van die patogeen aanneem (speeksel, bloed, urine, ontslag uit die geslagsdele), word in 'n spesiale reaktor (versterker) geplaas. Vervolgens word spesifieke ensieme daaraan gekoppel wat bind aan die DNA of RNA van die patogeen, en sy kopie word gesintetiseer. Hierdie kopiëring vind plaas in verskeie stadiums van 'n "kettingreaksie" tipe, en uiteindelik kan honderde en duisende kopieë van 'n enkele kopie van die genetiese materiaal gevorm word. Dan is daar 'n analise en vergelyking van die resultaat met die bestaande databasis oor die struktuur van verskeie patogene. Deur middel van PCR is dit moontlik om nie net die tipe patogeen te identifiseer nie, maar ook om 'n kwantitatiewe uitslag van die analise te lewer, dit is hoeveel patogene in die menslike liggaam is.

Die PCR-metode brei tans die omvang van navorsingsgeleenthede uit: die bekendstelling van mutasies, fragmentering van DNA-fragmente, en word wyd gebruik in medisyne, byvoorbeeld om vaderskap, die opkoms van nuwe gene, ensovoorts te vestig.

Watter infeksies kan opgespoor word met behulp van PCR diagnose

1) MIV-infeksie (kan menslike immuniteitsgebreksvirus MIV-1 opspoor)
2) Virale hepatitis A, B, C, G (RNA-HAV, DNA-HBV, RNA-HCV, RNA-HGV)
3) Infectious mononucleosis (DNA van Epstein-Barr virus-VEB)
4) Cytomegalovirus infeksie (DNA-CMV)
5) Herpesinfeksie (herpes simplex DNA - HSV tipe 1 en 2)
6) SOI's (seksueel oordraagbare infeksies) - ureaplasmose, gardnerellosis, chlamydia, mycoplasmosis, trichomoniasis,
7) Tuberkulose (Mycobacterium tuberculosis)
8) Onkogene virusse - menslike papillomavirus infeksie (menslike papillomavirus (insluitend die onkogene spesies 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58 en 59)
9) Borreliose, bosluisgebonde enkefalitis
10) Listeriose
11) Candida (swamme van die genus Candida)
12) Helicobacter pylori infeksie (Helicobacter pylori)
en ander

Учитывая спектр возбудителей, ПЦР-диагностика активно используется в гинекологической, урологической практике, практике инфекциониста, в пульмонологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, гематологии, онкологии и других.

Материал для исследования и правила его забора

Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК бактерии или ДНК или РНК вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека: слизи, моче, крови, мокроте, соскобе эпителиальных клеток, тканях плаценты, крови, соке простаты, околоплодные воды, плевральная жидкость.

Ondersoek van seksueel oordraagbare infeksies by mans en vroue behels afskeidings van die geslagsorgane, 'n smeer of skraapsel van die serviks, 'n smeer of skraapsel van urinêre urine, urine.

By die ondersoek van infeksies (herpes infeksies, CMVI, mononukleose, toksoplasmose, hepatitis B, C, MIV infeksie) word bloed op PCR versamel.

Vir die diagnose van aansteeklike mononukleose, word CMV, herpesinfeksie, 'n keelwolf geneem, en vir die toets vir CMV - urine. Dikwels, vir die ondersoek van letsels van die senuweestelsel, versamel 'n aantal studies spinale vloeistof.

In pulmonologie is die materiaal sputum, pleurale vloeistof.

By die ondersoek van intraderinale infeksies - amniotiese vloeistof, plasentale weefsel.

Voorbereiding vir die lewering van die materiaal en die PCR diagnostiek

Byna al die pasiënte wat PCR diagnose ondergaan, is geregtig om staat te maak op betroubare, akkurate en vinnige resultate, wat grootliks afhang van die kapasiteit van die laboratorium en die professionaliteit van die laboratoriumtegnikus. Terselfdertyd dink baie mense nie dat hierdie betroubaarheid in baie opsigte op onsself afhanklik is nie, naamlik op die aanbevelings van die behandelende dokter, die manier van lewe en die korrektheid van die materiaalmonstering. Wanneer die materiaal geneem word, word toestande vereis wat kontaminasie (besoedeling) van die materiaal uitsluit en dus die objektiwiteit van die analise bevraagteken.

Behoorlike voorbereiding vir die lewering van die materiaal is nie besonder moeilik nie. Die volgende dokter aanbevelings vir pasiënte bestaan:

1) om nie die sekslewe die dag voor die aflewering van die materiaal te hê nie,
2) bloed vir navorsing oorleef in die oggend op 'n leë maag (nie om te eet nie, nie te drink nie)
3) By aflewering van urine word die eerste oggendgedeelte in 'n skoon, steriele houer versamel.

Verduideliking van PCR resultate

negatiewe Die PCR-resultaat dui aan dat geen spore van aansteeklike middels in die materiaal wat op die tydstip van die studie ondervind is, gevind is nie. Die meeste gevalle toon die afwesigheid van infeksie, wat hulle in die toets probeer het.

positiewe Die PCR-resultaat dui op die opsporing van infeksiespore in die biologiese monster wat ondersoek word. Met 'n groot akkuraatheid dui 'n positiewe uitslag op die teenwoordigheid van 'n infeksie op 'n gegewe tydstip.

Daar is situasies waar PCR positief is en dit is onmoontlik om te praat oor aktiewe infeksie - dit is die sogenaamde "gesonde draerstaat" sonder kliniese simptome van die siekte, wat nie behandeling benodig nie, maar vereis dinamiese waarneming deur 'n dokter. Dit word vaker waargeneem in 'n aantal virusinfeksies (HPV, CMVI, EBV infeksie, herpes infeksie, ens.) In sulke materiale soos speeksel, skraap van die servikale kanaal, uretra, dit is van die plaaslike fokus. Ons moet egter nie vergeet dat oordrag van draers na gesonde mense moontlik is nie, net soos die oorgang na die chroniese vorm van die siekte met die aktiveringsproses. As PCR positief in die bloed is, is dit nie meer 'n draerstaat nie en vereis spesifieke behandeling.

Die kwantitatiewe uitslag van PCR word slegs deur 'n dokter individueel vir 'n infeksie geëvalueer en het nie gemeenskaplike gradasies nie. Gebaseer op die kwantitatiewe uitslag van PCR, kan die dokter die graad van infeksie-aktiwiteit bepaal en die stadium van die siekte bepaal, wat die kursus en dosisse voorgeskrewe middels beslis sal beïnvloed.

Een van die laaste opwindende vrae: hoe akkuraat is PCR diagnostiek?

Vir PCR analise is daar 3 definisies:

1. Akkuraatheid (met 'n hoë waarskynlikheid van moontlike opsporing of afwesigheid van infeksie).
2. Spesifisiteit (akkuraatheid van opsporing van 'n spesifieke infeksie).
3. Gevoeligheid (selfs met 'n lae inhoud van genetiese materiaal van patogene in die monster wat ondersoek word, sal die infeksie bespeur word).

Polimerase-kettingreaksie lewer byna geen vals-positiewe resultate (dit wil sê, daar is geen positiewe monsters waar daar geen infeksie is nie). Valse-negatiewe resultate word selde waargeneem (meer dikwels word dit geassosieer met die afwesigheid van aktiewe infeksie in 'n persoon op die oomblik). Byvoorbeeld, latente infeksie, chroniese infeksie buite aktiwiteit.

Die inhoud

In die vroeë 1970's het die Noorse wetenskaplike Kjell Kleppe van die laboratorium van die Nobelpryswenner Khara Gobinda Quran 'n metode voorgestel vir die versterking van DNA met behulp van 'n paar kort enkelstrengs DNA-molekules - sintetiese primers [1]. Op daardie tydstip was hierdie idee egter onvoltooid. Polimerase kettingreaksie (PCR) is in 1983 deur die Amerikaanse biochemikus Carey Mullis [2] [3] uitgevind. Sy doel was om 'n metode te skep wat DNA-amplifikasie in die loop van verskeie opeenvolgende verdubbeling van die oorspronklike DNA-molekuul met behulp van die ensiem DNA-polimerase sal toelaat. Die eerste publikasie op die PCR-metode verskyn in November 1985 in die tydskrif Science [4]. Die metode revolusionêre molekulêre biologie en medisyne. In 1993 het Carey Mullis hiervoor die Nobel-prys in Chemie ontvang. [5].

Aan die begin van die gebruik van die metode moes DNA-polimease na elke verhitting-verkoalsiklus by die reaksiemengsel gevoeg word, aangesien dit by die hoë temperatuur benodig vir die skeiding van die DNA-helix-kettings geïaktiveer is. Die reaksieprosedure was relatief ondoeltreffend, wat baie tyd en ensieme vereis. In 1986 is die polimerase kettingreaksie metode aansienlik verbeter. Daar is voorgestel om DNA-polimeases van termofiliese bakterieë te gebruik [6]. Hierdie ensieme was termostaatbaar en kon baie reaksiesiklusse weerstaan. Die gebruik daarvan het die PCR vereenvoudig en outomatiseer. Een van die eerste termostabiele DNA-polimerases is van bakterieë geïsoleer Thermus aquaticus en vernoem Taqpolimerase. Die nadeel van hierdie polimerase is die redelik hoë waarskynlikheid om 'n foutiewe nukleotied in te voer, aangesien hierdie ensiem geen meganismes vir die regstelling van foute het nie (3 '→ 5'-eksonuklease-aktiwiteit). polimerase Pfu en PWO, geïsoleer van argea, het hierdie meganisme; hul gebruik verminder die aantal mutasies in DNA aansienlik, maar hul spoed (prosesiwiteit) is laer as dié van Taq. Dien nou die mengsel toe Taq en Pfuom terselfdertyd hoë hardspoed en hoë kopie akkuraatheid te bereik.

Ten tyde van die uitvinding van die metode het Carey Mullis as 'n sintetiese chemikus gewerk (hy het oligonukleotiede gesintetiseer, wat destyds gebruik is om puntmutasies te identifiseer deur hybridisering met genomiese DNA) in Cetus (Cetus Corporation), wat die PCR-metode gepatenteer het. In 1992 verkoop Cetus die regte op die metode en patent om te gebruik Taq-polymeerase maatskappy Hofman-La Roche vir $ 300 miljoen. Dit blyk egter dat Taq-polymeer is deur die Sowjet-biochemikusse A. Kaledin, A. Slusarenko en S. Gorodetsky in 1980 [7] gekenmerk, en 4 jaar voor hierdie Sowjet-publikasie, dit is in 1976 deur die Amerikaanse biochemici Alice Chien, David B. Edgar en John M. Trela. [8] In hierdie verband het die maatskappy Promega in 'n geregtelike bevel probeer om Rosh te dwing om die eksklusiewe regte op hierdie ensiem af te wyk [9]. 'N Amerikaanse patent vir PCR het in Maart 2005 verval.

Die metode is gebaseer op die herhaalde selektiewe kopiëring van 'n sekere gedeelte van DNA-nukleïensuur met behulp van ensieme onder kunsmatige toestande (in vitro). As dit gebeur, word slegs die area wat aan die gespesifiseerde toestande voldoen, gekopieer, en slegs indien dit in die steekproef ondervind word. In teenstelling met DNA-versterking in lewende organismes (replikasie) word relatief kort dele van DNA versterk deur PCR. In 'n konvensionele PCR-proses is die lengte van die DNA-afdelings wat gekopieer moet word, nie meer as 3000 basispare (3 kbp [10] nie). Met behulp van 'n mengsel van verskillende polimerases, met die gebruik van bymiddels en onder sekere omstandighede, kan die lengte van die PCR-fragment 20-40 duisend basispare bereik. Dit is steeds aansienlik minder as die lengte van die chromosomale DNA van die eukariotiese sel. Byvoorbeeld, die menslike genoom bestaan ​​uit ongeveer 3 biljoen basispare [11].

Reaksie komponente Redigeer

In die eenvoudigste geval word die volgende komponente benodig vir PCR:

  • DNA matrikswat die DNA bevat wat versterk moet word.
  • Twee primerskomplementêr aan die teenoorgestelde punte van die verskillende kettings van die gewenste DNA-fragment.
  • thermostable DNA-polimerase - 'n Ensiem wat 'n DNA-polimerisasie reaksie kataliseer. Polimerase vir gebruik in PCR moet vir 'n lang tyd aktief wees teen hoë temperature, daarom word ensieme wat van termofiele geïsoleer word, gebruik - Thermus aquaticus (Taqpolimerase) Pyrococcus furiosus (Pfupolimerase) Pyrococcus woesei (PWOpolimerase) Thermus thermophilus (TTHpolimerase) en ander.
  • Deoksiribonukleosiedtrifosfate (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Mg 2+ ione benodig vir polimerase werking.
  • Bufferoplossingdie nodige reaksietoestande voorsien - pH, ioniese sterkte van die oplossing. Bevat sout, bees serum albumien.

Om verdamping van die reaksiemengsel te vermy, word 'n hoë kookolie, byvoorbeeld vaselineolie, by die buis gevoeg. As 'n verhittingspet gebruik word, is dit nie nodig nie.

Die toevoeging van pirofosfatase kan die opbrengs van die PCR-reaksie verhoog. Hierdie ensiem kataliseer die hidrolise van pirrofosfaat, 'n neweproduk van die toevoeging van nukleotiedtrifosfate na 'n groeiende DNA-ketting, na ortofosfaat. Pyrofosfaat kan die PCR-reaksie inhibeer [12].

Primers Edit

Die spesifisiteit van PCR is gebaseer op die vorming van komplementêre komplekse tussen die matriks en die primers, kort sintetiese oligonukleotiede met 18-30 basisse lank. Elk van die primers is komplementêr tot een van die kettings van die dubbelstrengige matriks en beperk die begin en die einde van die versterkte gebied.

Na hybridisering van die matriks met die primer (annealing [13]) dien die laaste as 'n primer vir DNA-polimerase tydens die sintese van die komplementêre ketting van die matriks (sien hieronder).

Die belangrikste kenmerk van die primers is die smeltpunt (Tma) komplekse primer-matriks.

Tm - die temperatuur waarteen die helfte van die DNA-sjabloon 'n kompleks vorm met 'n oligonukleotiedprimer. Gemiddelde Telling Formule Tm vir 'n kort oligonukleotied (en vir lang DNA fragmente), met inagneming van die konsentrasie van K + en DMSO ione:

waar L die aantal nukleotiede in die primer is, is K + die molêre konsentrasie van kaliumione, G + C is die som van alle guaniene en sitosiene.

In die geval van 'n verkeerde keuse van die lengte- en nukleotiedsamestelling van die primer of die ontledings temperatuur, is die vorming van gedeeltelik komplementêre komplekse met ander streke van die sjabloon DNA moontlik, wat kan lei tot die voorkoms van nie-spesifieke produkte. Die boonste limiet van die smeltpunt word beperk deur die optimum temperatuur van die polimerase waarvan die aktiwiteit by temperature bo 80 ° C val.

By die keuse van primers is dit wenslik om aan die volgende kriteria te voldoen:

40—60 %,

  • naby tm primers (verskille nie meer as 5 ° C nie)
  • die afwesigheid van nie-spesifieke sekondêre strukture - haarspelde [15] en dimers [16],
  • Dit is wenslik dat guanien of sitosien teen die 3'-terminus teenwoordig is, aangesien dit drie waterstofbindings met die matriksmolekule vorm, wat die baster meer stabiel maak.
  • Versterker Wysig

    PCR word uitgevoer in termiese siklus - 'n toestel wat periodieke verkoeling en verhitting van die buise voorsien, gewoonlik met 'n akkuraatheid van minstens 0.1 ° C. Moderne versterkers stel jou in staat om komplekse programme te stel, insluitend die moontlikheid van "warm begin", Touchdown PCR (sien hieronder) en die daaropvolgende berging van die versterkte molekules by 4 ° C. Vir real-time PCR word instrumente wat toegerus is met 'n fluorescent detektor, vervaardig. Daar is ook toestelle met 'n outomatiese deksel en 'n mikroplate kompartement, wat hulle in staat stel om in outomatiese stelsels te bou.

    Tipies word 20-35 siklusse uitgevoer tydens PCR, wat elk uit drie stadiums bestaan ​​(Figuur 2).

    Denaturering Wysig

    Die dubbelstrengige DNA-sjabloon word verhit tot 94-96 ° C (of tot 98 ° C, indien 'n besonder stabiele termostabiele polimerase gebruik word) vir 0,5-2 minute, sodat die DNA-kettings geskei word. Hierdie stadium word smelt genoem (denaturasie), omdat die waterstofbindings tussen twee stringe DNA vernietig word. Gewoonlik word voor die eerste siklus 'n lang opwarming van die reaksiemengsel uitgevoer vir 2-5 minute om die sjabloon en die primers volledig te benadruk.

    Annealing Edit

    Wanneer die kettings geskei word, word die temperatuur verlaag sodat die primers aan die enkelstrengmatriks kan bind. Hierdie stadium word genoem uitgloeiing. Die uitgloeitemperatuur hang af van die primer samestelling en word gewoonlik 5 grade laer as die smeltpunt van die primers gekies. Die verkeerde keuse van ontgloeitemperatuur lei óf tot swak binding van die primers na die matriks (by verhoogde temperatuur), óf om te bind op die verkeerde plek en die voorkoms van nie-spesifieke produkte (by lae temperatuur). Die tyd van die ontgloeiingsfase is 30 sekondes. Terselfdertyd het die polimerase reeds tyd om 'n paar honderd nukleotiede te sintetiseer. Daarom word aanbeveel om primers met 'n smeltpunt bo 60 ° C te kies en gelyktydig te verleng en verlenging by 60-72 ° C.

    Verlenging Wysig

    DNA-polimerase repliseer die sjabloonstreng deur die primer as 'n saad te gebruik. Dit is die verhoog verlenging. Die polimerase begin die sintese van die tweede ketting vanaf die 3'-einde van die primer wat met die matriks geassosieer word, en beweeg langs die matriks en sintetiseer 'n nuwe ketting in die rigting van 5'- tot 3'-einde. Die verlengingstemperatuur is polimerase afhanklik. Dikwels gebruik polimerase Taq en Pfu mees aktiewe by 72 ° C. Die verlengingstyd hang af van beide die tipe DNA-polimerase en die lengte van die versterkte fragment. Gewoonlik is die verlengingstyd gelyk aan een minuut vir elke duisend basispare. Na afloop van alle siklusse word 'n addisionele stadium dikwels uitgevoer. finale verlengingOm alle enkelkettingfragmente te voltooi. Hierdie stadium duur 7-10 minute.

    Die hoeveelheid van 'n spesifieke reaksieproduk (beperk deur primers) verhoog teoreties in verhouding tot 2 n - 2n, waar n die aantal reaksiesiklusse is [17]. Trouens, die doeltreffendheid van elke siklus mag minder as 100% wees, dus in werklikheid P

    (1 + E) n, waar P die hoeveelheid van die produk is, E die gemiddelde doeltreffendheid van die siklus.

    Die aantal "lang" kopieë van DNA groei ook, maar lineêr, so 'n spesifieke fragment oorheers in die reaksieprodukte.

    Die groei van die vereiste produk in meetkundige progressie word beperk deur die hoeveelheid reagense, die teenwoordigheid van inhibeerders, die vorming van neweprodukte. In die laaste siklusse van die reaksie vertraag groei, dit word die "plato-effek" genoem.

    • RPA (English Recombinase Polymerase Amplification - Recombinase Polymerase Amplification) - Gebruik waar amplifisering van DNA / RNA vir 15 minute benodig word sonder termiese siklus (isotermiese reaksie) [18] [19]
    • Geneste PCR (Nested PCR (Eng.)) - gebruik om die aantal byprodukte van die reaksie te verminder. Twee pare primers word gebruik en twee opeenvolgende reaksies word uitgevoer. Die tweede paar primers versterk 'n gebied van DNA binne die produk van die eerste reaksie.
    • Omgekeerde PCR (Inverse PCR (Eng.)) - word gebruik indien slegs 'n klein gedeelte binne die verlangde volgorde bekend is. Hierdie metode is veral nuttig wanneer dit nodig is om aangrensende reekse na DNA-invoeging in die genoom te bepaal. Vir die implementering van omgekeerde PCR word 'n reeks DNA sny met restrictases uitgevoer, gevolg deur die fragmente (ligasie) te verbind. As gevolg daarvan verskyn die bekende fragmente aan albei kante van die onbekende streek, waarna PCR soos gewoonlik uitgevoer kan word.
    • PCR met omgekeerde transkripsie (Reverse Transkripsie PCR, RT-PCR (Engels)) - gebruik om 'n bekende volgorde uit 'n RNA-biblioteek te versterk, te isoleer of te identifiseer. Voordat konvensionele PCR, word 'n enkelstrengs DNA-molekuul gesintetiseer op die mRNA-sjabloon met behulp van revertase en word 'n enkelstrengs-cDNA verkry, wat as 'n sjabloon vir PCR gebruik word. Hierdie metode bepaal dikwels waar en wanneer hierdie gene uitgedruk word.
    • Asimmetriese PCR (Engelse Asimmetriese PCR) - word uitgevoer wanneer u hoofsaaklik een van die kettings van die oorspronklike DNA moet versterk. Word gebruik in sommige volgordebepaling en hibridisasie toetse. PCR word soos gewoonlik uitgevoer, behalwe dat een van die primers in groot oormaat geneem word. Wysigings van hierdie metode is Engels.Linear-After-Thy-Exponential-PCR (LATE-PCR), wat primers met verskillende konsentrasies gebruik, en 'n lae konsentrasie primer word gekies met 'n hoër (smeltpunt) as 'n hoë konsentrasie primer. PCR word uitgevoer teen 'n hoë ontledings temperatuur, waardeur die doeltreffendheid van die reaksie in alle siklusse [20] onderhou kan word.
    • Kwantitatiewe PCR (Kwantitatiewe PCR, Q-PCR (Engels)) of Real-time PCR - gebruik vir direkte waarneming van die meting van die hoeveelheid van 'n spesifieke PCR produk in elke reaksiesiklus. Hierdie metode gebruik fluorescens-gemerkte primers of DNA probes om die hoeveelheid van die reaksieproduk akkuraat te meet soos dit ophoop, of 'n fluoresserende intercalerende kleurstof word gebruik. Sybr groen i (maar beter om te gebruik SYTO 13), wat aan dubbelstrengs DNA bind. Sybr groen i bied 'n eenvoudige en ekonomiese opsie vir die opsporing en kwantifisering van PCR produkte tydens real-time PCR sonder die behoefte aan spesifieke fluorescerende probes of primers. Tydens die versterkings kleurstof SYBR Green I Dit word in die geringe groef van DNA van PCR-produkte ingevoeg en gee 'n fluorescerende sein, sterker as dié van ongebonde kleurstof, wanneer dit met 'n blou laser bestraal word. SYBR Green I совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный) [21] .
    • Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.) ) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Die eerste siklusse word uitgevoer teen 'n temperatuur bokant die optimum verwelkingstemperatuur, dan word die uitwissingstemperatuur geleidelik tot die optimum verminder. Dit word gedoen om te verseker dat die primer met die komplementêre ketting oor sy hele lengte bots, terwyl die primer met die optimum ontkalkingstemperatuur gedeeltelik met die komplementêre ketting hybridiseer. Gedeeltelike hibridisasie van 'n primer op genomiese DNA lei tot nonspesifieke amplifikasie, indien daar baie bindende terreine vir die primer is. In die meeste gevalle kan die eerste tien siklusse van PCR uitgevoer word teen 'n gloeitemperatuur van 72-75 ° C en dan onmiddellik verminder tot optimale, byvoorbeeld tot 60-65 ° C.
    • Molekulêre Kolonie Metode (PCR in gel, Engelse kolonie - PCR-kolonie) - akrylamiedgelpolimerisasie met alle komponente van PCR op die oppervlak en voer PCR uit. By die punte wat die geanaliseerde DNA bevat, ontstaan ​​versterking met die vorming van molekulêre kolonies.
    • PCR met vinnige versterking van cDNA-eindes (gebore Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR).
    • PCR van lang fragmente (Eng. Langafstand PCR) - Modifikasie van PCR vir versterking van uitgebreide DNA-streke (10 duisend of meer basisse). Gebruik 'n mengsel van twee polimerase, waarvan een - Taq-polymeer met hoë prosessiwiteit (wat 'n lang ketting van DNA in een pas kan sintetiseer) en die tweede is 'n DNA-polimerase met 3'-5'-eksonuklease-aktiwiteit, gewoonlik polimerase Pfu. Die tweede polimerase is nodig om die eerste foute reg te stel Taq-polymerase stop DNA sintese as 'n nie-komplementêre nukleotied bygevoeg is. Hierdie nie-komplementêre nukleotied verwyder Pfu-polimerase. 'N Mengsel van polimerase word in 'n verhouding van 50: 1 of selfs minder as 100: 1 geneem, waar Taq-Polimerase word 25-100 keer meer as geneem Pfupolimerase.
    • RAPD (Eng. Random Amplification of Polymorphic DNA), PCR met ewekansige versterking van polymorfe DNA - word gebruik wanneer organismes soortgelyk in genetiese volgorde onderskei word, byvoorbeeld verskillende variëteite van gekweekte plante, honderasse of verwante mikroörganismes. In hierdie metode word een klein primer (ongeveer 10 bp) gewoonlik gebruik. Hierdie primer sal gedeeltelik komplementêr wees met ewekansige DNA-streke van die bestudeerde organismes. Deur die toestande (primer lengte, samestelling, temperatuur, ens.) Te kies, is dit moontlik om 'n bevredigende verskil in die PCR-patroon vir die twee organismes te bereik.
    • Groepspesifieke PCR (groepspesifieke PCR) - PCR vir verwante rye binne een of tussen verskillende spesies deur konserwatiewe primers vir hierdie rye te gebruik. Byvoorbeeld, seleksie van universele primers vir ribosomale gene 18s en 26S vir die versterking van 'n spesiespesifieke intergeniese spacer: geenvolgorde 18s en 26S konserwatiewe tussen spesies; daarom sal PCR tussen hierdie gene uitgevoer word vir alle spesies wat bestudeer word. Die teenoorgestelde van hierdie metode is unieke PCR (eng. unieke PCR), waar die taak primers is om slegs een volgorde van alle verwante kinders te versterk.
    • PCR met warm begin (Engelse Hot-start PCR) - Modifikasie van PCR met DNA-polimerase, waarin polimerase-aktiwiteit by kamertemperatuur geblokkeer word met teenliggame of klein molekules van die Affibody-tipe wat nabootsende antimikroppe naboots, dit wil sê op die oomblik dat die reaksie voor die eerste denaturasie in PCR gestel word. Tipies word die eerste denaturering vir 10 minute by 95 ° C uitgevoer.
    • Virtuele PCR (in siliko-PCR, digitale PCR, elektroniese PCR, e-PCR) is 'n wiskundige metode van rekenaarontleding van 'n teoretiese polimerase kettingreaksie deur 'n lys van primervolgorde (of DNA probes) te gebruik om die potensiële versterking van die DNA van die genoom, chromosoom, sirkelvormige DNA of enige ander stuk DNA.

    As die nukleotiedvolgorde van die sjabloon gedeeltelik of onbekend is, kan jy dit gebruik ontaarde primerswie se volgorde bevat ontaarde posisies waarin enige basisse geleë kan wees. Byvoorbeeld, die primer volgorde kan wees: ... ATH ...waar H is A, T of C.

    PCR word in baie gebiede gebruik vir analise en in wetenskaplike eksperimente.

    Forensics Edit

    PCR word gebruik om sogenaamde "genetiese vingerafdrukke te vergelyk." 'N Monster van die genetiese materiaal van die misdaadtoneel - bloed, speeksel, semen, hare, ens. - is nodig. Dit word vergelyk met die genetiese materiaal van die verdagte. 'N baie klein hoeveelheid DNA is genoeg, teoreties, een kopie. Die DNA word in fragmente gesplit, dan versterk deur PCR. Fragmente word geskei deur DNA elektroforese. Die gevolglike patroon van die rangskikking van die DNA-bande word genoem genetiese vingerafdruk (genetiese vingerafdruk).

    Mediese Diagnostiek Redigeer

    PCR maak dit moontlik om die diagnose van oorerflike en virussiektes aansienlik te bespoedig en te fasiliteer. Die verlangde geen word versterk deur PCR deur gepaste primers te gebruik, en dan om die mutasies te bepaal. Virale infeksies kan onmiddellik na infeksie, weke of maande opgespoor word voordat simptome van die siekte voorkom.

    Gepersonaliseerde medisyne Redigeer

    Soms is dwelms giftig of allergies vir sommige pasiënte. Die redes hiervoor is deels in individuele verskille in vatbaarheid en metabolisme van dwelms en hul derivate. Hierdie verskille word op die genetiese vlak bepaal. Byvoorbeeld, in een pasiënt kan 'n sekere sitochroom (lewerproteïen, wat verantwoordelik is vir die metabolisme van vreemde stowwe) meer aktief wees, in nog minder. Ten einde te bepaal watter tipe sitochroom hierdie pasiënt het, word voorgestel om PCR-analise uit te voer voordat die geneesmiddel gebruik word. [ Bron nie gespesifiseer nie 3300 dae ] So 'n analise word voorlopige genotipering genoem (Engelse voornemende genotipering).

    Gene kloning Redigeer

    Gene kloning (nie verwar word met die kloning van organismes nie) is die proses om gene te isoleer en, as gevolg van genetiese manipulasie manipulasies, verkry 'n groot hoeveelheid van die produk van 'n gegewe geen. PCR word gebruik om 'n geen te versterk, wat dan ingevoeg word vektor - DNA-fragment wat 'n uitheemse geen in dieselfde of ander dra, gerieflik vir groei, organisme. As vektore word byvoorbeeld plasmiede of virale DNA gebruik. Die invoeging van gene in 'n vreemde organisme word gewoonlik gebruik om die produk van hierdie geen te verkry - RNA of, meestal, proteïen. Dus, in industriële hoeveelhede, word baie proteïene verkry vir gebruik in landbou, medisyne, ens.

    DNA volgorde volgorde

    In die volgordebepaling metode wat 'n fluorescens gemerk of radioaktiewe isotoop van dideoxynukleotiede gebruik, is PCR 'n integrale deel, aangesien dit tydens die polimerisasie is dat nukleotiede gemerk met 'n fluoresserende of radioaktiewe etiket in die DNA-string ingevoeg word. Die toevoeging van die dideoxynukleotied na die gesintetiseerde ketting lei tot 'n breuk in die sintese, wat dit moontlik maak om die posisie van spesifieke nukleotiede na skeiding in die gel te bepaal.

    Kyk na die video: PCR Reação em cadeia da POLIMERASE (November 2019).

    Loading...